开云官方网址最新·CGT器械报告：需求激增释放巨大市场潜能（上）

　　通过标准化程序自动控制的方法，配合密闭的无菌管道完成各种复杂的细胞操作，有效避免了人工操作过程中可能出现的失误和污染风险，极大地提高实验效率，保证GMP级细胞制备的可重复性。

　　1.1.概念分类细胞治疗是指将正常或经过生物工程改造过的细胞移植或输入患者体内，从而达到治愈患者的技术。根据治疗时所用到的细胞种类进行分类可以分为：干细胞疗法和免疫细胞疗法。

　　干细胞治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的，可以应用于神经系统疾病、免疫系统疾病和外科疾病。据统计全球范围内曾经获准上市的间充质干细胞产品有18款，其中符合药品定义的有10款，主要适应症为骨修复。

　　免疫细胞治疗是指从患者体内分离出免疫细胞，经过体外处理后再回输到患者体内，识别肿瘤细胞并进行选择性杀伤，起到治疗肿瘤的作用。按照免疫细胞是否经过基因工程改造可分为两大类：未经改造的主要包括调节性T细胞（Treg）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。经基因工程改造的主要包括嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）、T细胞受体T细胞（TCR）、嵌合抗原受体自然杀伤细胞（CAR-NK）。

　　图表数据为PubMed网站有关细胞治疗文章的历年收录情况，从数据趋势上可以看出学术界对于细胞治疗的关注度在逐年上升。弗若斯特沙利文数据预测2020年到2025年间CAR-T治疗的市场规模增速将达到53%。

　　根据弗若斯特沙利文数据预测国内细胞治疗市场规模自2021年开始将维持快速增长的势头，预计到2030年国内细胞治疗的市场规模将达到584亿人民币。市场规模增加也加大了对于上游试剂耗材的需求，预测到2030年试剂耗材的市场规模将达到204亿人民币。

　　细胞治疗产品的生产过程可以分为质粒制备、病毒制备和细胞工艺流程三大部分。质粒是用于制备病毒载体的原材料，在三质粒转染体系中包含一个穿梭质粒、一个包膜质粒和一个包装质粒。穿梭质粒带有所需要的外源目的基因，包膜质粒和包装质粒上带有用于病毒生产的基因。将上述三个质粒共同转入宿主细胞中后可以产生出包裹着目的基因的病毒。再用得到的病毒去侵染目的细胞，通过这样的方式就可以将目的基因整合到宿主细胞的基因组中，在CAR-T治疗体系中，就是通过病毒载体将CAR基因转入T细胞中。

　　质粒是一种存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，也是目前细胞治疗过程中最重要的工具之一，可以在体外转染改造靶细胞，或在体外多质粒共转染细胞产生病毒载体。目前质粒DNA的生产一般基于在大型不锈钢生物反应器中使用大肠杆菌发酵的方法，尽管质粒的GMP生产技术相对成熟，但商业化大规模生产仍具有较高的技术壁垒。质粒生产流程涉及质粒构建、菌株库构建、发酵及纯化等多个步骤，生产流程长、过程复杂难控、容错率低，操作不当会使得整批产品报废。这一阶段所需的时间在7-10天。

　　利用质粒能够与细菌共存的这一特点，可以将质粒导入大肠杆菌中，让质粒的数量随着大肠杆菌的增殖而同步增加。大肠杆菌在合适的生长条件下，每20分钟就可以繁殖一代，同时扩增过程中可以选择不含有动物源成分的培养基，可以减少一部分质控的步骤。

　　为了保证下游产品的稳定性，所以在质粒的生产过程中会采取生产体系放大的工艺，以保证在一次生产流程中得到足量的产物。放大工艺中需要用到生物发酵罐。

　　大肠杆菌扩增完成后需要将其从培养体系中分离，常用的方式有离心和中空纤维切向流过滤。离心适用于实验室的生产模式，在大规模生产体系中不具有效率优势。中空纤维切向流过滤，也称错流过滤，进样液流平行于膜表面，部分料液穿过膜（滤液），其余料液（回流液）循环回到进样容器。这样的液体过滤方式可以防止分子在膜表面聚积而造成堵塞，维持过滤体系的整体效率。

　　大肠杆菌的裂解方法有很多，常用的是碱裂解法。在碱性条件下，大肠杆菌的蛋白质、RNA、宿主DNA和质粒释放到溶液中并变形，大量变性的蛋白质和宿主DNA被沉淀，而质粒由于分子量较小，很容易复性。

　　大肠杆菌裂解的过程中会使用到大量的液体试剂，会使裂解液体积增加，在层析纯化前进行浓缩和洗滤，不仅可以大大减小样品体积，还可以有效去除RNA、色素和部分宿主蛋白、宿主DNA等杂质，少层析阶段的负荷。

　　基于成本考虑在澄清步骤中会采用CaCl2絮凝及NH4HCO3沉淀的方式，通过深层过滤以及除菌过滤得到澄清料液。对于质粒的超滤浓缩，一般按照如下标准进行 NWMC（GE 中空纤维）的选择，中空纤维的低剪切力特点可以有效保护质粒的超螺旋构象。

　　裂解液经过超滤浓缩后，样品中主要杂质有RNA残留、开环DNA和内毒素。针对这三种杂质，可以通过三步层析一一除去达到纯化的目的。

　　第一步采用凝胶过滤层析，该步的目的是除去大量RNA残留。高浓度硫酸铵（≥1.5 M硫酸铵）的平衡液使RNA和质粒的空间大小的差异性达到了最大，RNA可以进入凝胶颗粒内部，所以流速较慢，而质粒通过层析柱的外水体积首先流出。本步层析以后，质粒已经达到了很高的纯度，琼脂糖凝胶电泳几乎看不到RNA杂带。

　　第二步采用亲和层析，主要目的是去除开环质粒。经过凝胶过滤质粒已经被置换到高浓度硫酸铵的缓冲液中，可以直接上样至亲和层析柱。在此条件下开环质粒和超螺旋质粒均与层析柱结合，上样结束后，首先用2.0M硫酸铵的缓冲液冲洗层析柱可以将开环质粒洗脱，随后使用含有1.7M硫酸铵和0.3M氯化钠的缓冲液将超螺旋质粒洗脱，实现开环质粒和超螺旋质粒的分离。

　　第三步采用阴离子交换层析，主要目的是去除内毒素。其主要来源为大肠杆菌，是质粒一个重要风险杂质。商用的无内毒素质粒抽提试剂盒，其内毒素能达到的标准只有100EU/mg质粒。质粒带有高密度的负电荷，可以在高盐浓度下与强阴离子交换填料结合，而内毒素在此高盐情况下不与填料结合，从而实现去除内毒素的效果，此步骤处理后内毒素含量可以降至1EU/mg。

　　层析分离后，样品在所选缓冲液中浓缩和洗滤。操作与层析前切向流过滤的条件大致相同。而对于除菌过滤，由于终产品较大的尺寸和高黏度，且可能对剪切力敏感，会有额外的挑战，一些关键的考量因素包括盐浓度、膜类型、pDNA纯度以及如何定义过滤终点等。

　　生产是细胞治疗药物研发的核心。通常病毒载体的生产涉及上游的载体表达和下游的分离纯化。载体的生产涉及十分复杂的工艺，难度极高，且制备周期较长，同时GMP生产涉及复杂的生产体系和严格的质量控制体系，这直接导致了全球范围内的病毒载体GMP产能接近瓶颈。这一阶段所需的时间在2-3周。

　　病毒自身不具备扩增的能力，所以它的扩增方法需要依赖于宿主进行。目前常用的宿主细胞为HEK293T，该细胞的增殖能力和转染效率都要高于HEK293细胞系，同时可以在无血清的培养基中悬浮生长，这个特性对于大规模载体生产非常有利。将病毒质粒转入细胞后，借助细胞内的表达体系完成对病毒的生产。

　　传统上采用10-24个CF-10设备，一个生产周期可以收获的体积介于20-52升。但是这种方法属于开放体系生产，存在较高的污染风险。为了降低污染风险，可以采用封闭的全自动培养体系中空纤维的慢病毒生产系统，首先将HEK293T接种到中空纤维生物反应器中（HF），待细胞贴壁24小时后将质粒转染进HEK293T细胞，产量与3个CF-10叠层相当。

　　虽然转染贴壁细胞是生产慢病毒的金标准，但是这个方法在大规模生产上游诸多限制。对工业化生产来说，在大的生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式。在悬浮培养体系下，细胞可以通过不同的容器进行扩大：摇瓶、不锈钢生物反应器、培养袋及一次性搅拌容器。其中波浪式一次性生物反应器的体系可以达到50L的生产规模。

　　经过质粒转染之后的细胞会将生产出来的病毒释放至培养基中，由于是大体系的生产模式，实验室采用的离心分离方式已不再适用，所以这一步分离是基于膜和色谱技术的过滤，过程步骤的组合是可变的。主要包括三个阶段：1）从粗制或澄清细胞培养物中初步纯化捕获目标载体，并消除主要污染物；2）中间纯化处于捕获和精纯阶段之间，主要去除特定的杂质（蛋白质、DNA 和内毒素）；3）最后是精纯，旨在去除痕量和杂质，以适合制剂的形式产出活性产品。

　　这一步中使用Frontal filtration 0.45µm的过滤体系进行过滤，来去除细胞和细胞碎片等杂质。

　　使用切向流过滤/超滤或者体积排阻色谱法来对病毒进行浓缩，浓缩后样本的体积减小，这时可以采用超速离心的方式对病毒进行纯化。

　　大多数操作规程的灭菌步骤是采用0.2µm的膜过滤。这是在GMP条件下降低最终产品微生物污染风险的标准法规要求。该操作必须在符合Class100(美国)或Grade A(欧盟)标准的环境内进行。2.3.细胞工艺现阶段用于细胞治疗的细胞来源还是以患者提供为主，这就需要从患者体内采集用于后续改造的细胞。比如用于CAR-T、TCR-T治疗的T细胞，NK细胞等。这一阶段所需的时间在10-15天，以下步骤是基于CAR-T细胞治疗流程进行描述。

　　使用外周血采集的方式从患者体内获得全血样本，随后采用Ficoll密度梯度离心法从全血中分离得到外周血单个核细胞（PBMC）。为了从PBMC中分离得到T细胞，可以采用磁性分选技术（MACS）分离，这个过程中将会使用到CD3/CD28抗体偶联磁珠，以及磁力分选仪。

　　分离得到的T细胞通过TCR/CD3复合物和共刺激CD28受体 (实现最佳T细胞活化所必需的) 接收激活信号。同时在IL-2存在的情况下，T细胞开始增殖。随后用病毒载体对T细胞进行修饰，最终的转染效率可以通过检测处理后细胞的荧光表达水平来确定。

　　为了达到治疗效果，经过修饰后的T细胞还需要经过体外扩增的步骤。修饰过的T细胞将会被转移到一次性封闭式细胞培养袋中，放置在一次性生物反应器上进行大规模增殖，通过自动灌流方案提高细胞密度，同时可以实时监控反应体系的运行状况。

　　扩增后的细胞不能直接用于治疗，还需要经过浓缩分装等步骤。简单来说是使用细胞处理仪把T细胞的浓度增加到1X1010/50ml（不同品牌仪器建议的细胞浓度存在差异）。向浓缩后的细胞中加入成分为 PLASMALYTE A 含有50% CryoStor™ CS10 (BioLife Solutions) 和 5% human serum albumin的冻存液，随后分装到细胞冻存袋中。

　　细胞的冻存采用梯度降温的方法，降温速度设定为每分钟下降1摄氏度，直到温度下降至-100摄氏度，随后将细胞转入液氮中保存。复苏时常采用干式细胞复苏仪，可以详细记录复苏时的数据，同时避免传统水浴复苏过程中可能出现的污染风险。

　　首先用于质粒、病毒和细胞处理的生产环境需要符合GMP规范，2019年11月，NMPA食品药品审核查验中心发布《GMP附录-细胞治疗产品》（征求意见稿），是国内首部针对细胞治疗产品的GMP附录，对细胞治疗产品的生产质量控制做出明确规范。该附录中，要求“细胞治疗产品、病毒载体和质粒的生产应当分别在各自独立的生产区域进行，并配备独立的空调净化系统”，以此防止交叉污染。同时GMP规范要求阳性供体材料（常见于自体疗法，异体基本不存杂）的生产操作应在独立的专用生产区域进行，对密闭系统、隔离器和隔离贮存同样作出要求。

　　无菌隔离技术分为洁净室、限制进出屏障系统（RABS）、隔离器3大类。洁净室将操作人员、操作环境和操作对象混在一个空间，人员安全与样品污染风险大，维护成本。