开云官方网址最新·急性髓系白血病体外药物敏感性检测技术应用与临床精准

　　化学药物的优点是，分子量较小，分子结构、药效学和药代动力学清晰，运输、储存和使用方便，因而成为疾病治疗的首选药物。

　　蔺丽慧，副主任技师。上海市第一人民医院检验医学中心流式细胞组组长。临床从事流式细胞术免疫分型及血液系统疾病流式细胞术诊断工作。曾获得国家自然科学基金，上海市卫生局青年项目，上海市“医苑新星”优秀青年检验人才资助计划等项目。累计发表研究论文十余篇，参编著作5部。目前上海医学会检验医学分会流式学组成员，上海医师协会检验医师分会会员。

　　李莉，主任医师/主任技师，博士生导师。现任上海市第一人民医院检验医学中心主任。长期从事肥大细胞与疾病研究，培养研究生40余名。获得国家自然科学基金等课题30余项，发表论文140余篇，著作21部。目前是中华医学会检验医学分会和微生物与免疫学分会副主任委员，中华医学检验教育学院副院长，中国老年保健研究会学检验分会副主任委员，中国医师协会检验医师分会副会长，中国医院协会检验专业委员会。

　　急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是髓系祖细胞基因突变或转录失调导致未成熟的原幼细胞在骨髓中增生、积聚，正常血细胞增殖、分化受到抑制，最终骨髓造血功能丧失的侵袭性血液肿瘤1,2。近年来越来越多的研究聚焦AML重现性基因突变及细胞遗传学异常，借此提示患者对治疗的反应及治疗后复发的风险，并不断研发针对特异性基因的小分子及靶向药物3。然而，虽然经过几十年的探索，临床对各危险度AML患者的初治仍然根据经验选择一、二线化疗药物进行诱导缓解治疗，以期尽快尽早清除患者体内白血病细胞。通过经典的“7+3”方案即服用3天蒽环类药物联合7天阿糖胞苷的治疗后，小于60岁的成年患者中60-80%可以获得完全缓解，而大于60岁的患者中仅有40-60%可获得完全缓解4。研究表明，患者的白血病细胞对所选择的化疗药物敏感，并且在前两个化疗周期内获得完全缓解是改善患者无病生存率及总体生存率的独立预后因素5。然而，细胞遗传学及测序分析将AML分为至少11种遗传学类型的白血病，同时考虑白血病细胞的分化程度时，AML则可进一步分为20多种亚型3。因此AML具有高度异质性的生物学特征，临床亟需探索白血病细胞对相关化疗药物敏感性的检测方法，以指导化疗药物的选择，实现精准治疗，不仅可使初发患者在第一时间获得最大程度的缓解，还能避免盲目性治疗产生的毒性和耐药性，进而提高治疗有效率和患者生存率。针对上述问题，本文对AML患者白血病细胞的化疗药物敏感性评估，以及药物个体化选择方面的研究进展进行论述。

　　随着精准医学在治疗领域的发展，肿瘤的个体化药物敏感性筛查逐渐得到研究者的重视。基于细胞的药物敏感性测试是肿瘤个体化治疗的评价手段之一。研究者普遍认为，如果待测的细胞毒性药物在体外测试体系中不能杀死肿瘤细胞，那么这种化疗药物应用于内也很难达到良好的肿瘤抑制效果6。基于这一理念，开启了根据药物作用后体外培养细胞的活力，判断白血病患者化疗药物敏感性检测方法的探索之路7-10。

　　1. DNA合成掺入法检测细胞增殖：肿瘤细胞具有高代谢的特征。DNA合成是细胞生长的必要条件，常被用来进行细胞增殖、细胞活力及凋亡的测定。其中放射性核素胸腺嘧啶（3H-TdR）掺入法为用同位素3H标记TdR作为DNA合成的前体，掺入DNA合成代谢的过程。通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况，用于化疗药物的敏感性预测11,12。Zittoun R等13,14曾研究53例AML患者体外培养的白血病细胞。通过放射自显影和液体闪烁计数检测DNA合成过程中3H-TdR的掺入情况，进而评估白血病细胞在体外对化疗药物的敏感性。研究发现，对化疗药物敏感的患者治疗前3H-TdR掺入率高。诱导化疗后获得缓解的患者，其体外培养的白血病细胞在两种诱导药物作用下3H-TdR掺入指数显著下降，下降程度高于对诱导化疗耐药的患者。这一发现体现了DNA合成代谢检测对于临床预后判断的重要性，并可以作为细胞毒性药物筛选的手段。但由于放射性元素对操作人员的损害，及实验废弃物需要特殊处理，使该方法较难在临床推广使用，并逐步被其他检测方式取代。BrdU（5-bromo-2-deoxyuridine）与EdU（5-ethynyl-2-deoxyuridine）为两种胸腺嘧啶核苷类似物，可掺入到新合成的DNA链中作为标记物用于检测细胞增殖，是一种新型的非放射性同位素细胞增殖检测方法，适用于临床药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定等15-18。DNA合成掺入法检测的局限是该方法仅能评估白血病细胞中一小部分具有高增殖性的白血病干细胞。

　　2. 集落形成法（HTCA）：1994年Lapidot等19首次通过特异性细胞表面标志分离出了人AML的白血病干细胞(LSC)，发现只有LSC才具有不断增殖、自我更新并维持其恶性侵袭性的能力。LSC虽仅占白血病细胞的1%左右，却成为疾病复发及髓外播散的根源。白血病细胞在体外适当的环境条件下进行培养，其中具有增殖能力的干细胞可以在半固体培养基上形成集落。因此，研究者认为检测化疗药物体外干扰LSC集落形成能力的试验研究可以为临床提供药物治疗敏感性的依据。Chan H. Park等20评价了体外培养的白血病细胞持续给予化疗药物作用，其克隆形成情况与临床治疗反应的相关性。在21例蒽环类药物与ARA-C联合化疗的患者中，相应的体外集落形成实验提示11例完全缓解患者中的8例对化疗敏感，10例未缓解患者中7例体外实验耐药。该方法预测体外药物敏感性与临床治疗的符合率达71%。集落形成法的优势在于直接测定化疗药物对于白血病细胞中最活跃的成分，即LSC的作用效果。但由于操作繁琐，难以标准化，且耗时较长（培养时间2周左右）不能早期指导临床治疗，因此不适用于临床常规应用。

　　3. 四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）：早在1989年，J.M.Sargent首次报道21采用MTT法评估体外培养的白血病细胞对化疗药物的敏感性。其原理是活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶将可溶性的唑盐还原为不溶的蓝紫色结晶甲瓒，沉积于细胞内。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，通过分光光度计在570nm波长处测定吸光值来间接反映活细胞的数量。

　　2001年，日本学者S Yamada进行了一项儿童AML体外化疗药物敏感性与体内疗效的相关性研究22。骨髓或外周血样本取自132例初诊AML儿童患者，经分离提取获得的白血病细胞在体外培养。不同浓度的13种待测化疗药物加入白血病细胞培养体系。4天后，采用MTT法检测细胞活力，评估药物在体外对白血病细胞的杀伤能力。结果表明，诱导缓解失败的患者体外实验即表现出对阿糖胞苷、依托泊苷、阿柔比星等药物显著的耐受性。该方法应用于AML可以快速帮助临床医生筛选有效的化疗药物及组合，并且可以在治疗过程中根据结果调整用药，尤其有助于缓解后复发患者筛选到有效的化疗药物。其特点是检测方法简便、成本低，但准确性较差，灵敏度较低，无法区分肿瘤细胞与正常细胞，且该方法中的有机溶液对对检测操作者有损害。

　　4. 荧光微培养细胞毒性测定（The fluorometric microculture cytotoxicity assay, FMCA）：FMCA是一种基于微孔板培养的非克隆形成性细胞活力测定法，用于体外测量不同药物的细胞毒性和/或抑制细胞生长的作用。该测定基于具有完整质膜的细胞中酯酶对探针二乙酸荧光素（FDA）的水解作用，产生具有荧光的极性物质，该荧光物质不能透过细胞膜溢出，因此检测荧光物质可以反映细胞的活力及数量。用少量药物溶液制备药物培养板，将细胞接种在平板上，培养2-4天后采用FDA溶液孵育，在485/520nm波长处检测荧光强度，评估细胞活力23。该方法敏感度较MTT法高24，且孵育时间短，有利于观察细胞活力水平的变化，还可同时观察细胞形态学改变。

　　Larsson R25的研究采用FMCA法检测了来自35名白血病患者的43份骨髓/外周血样本，通过分析一组药物的作用结果发现白血病细胞在体外对各种化疗药物的反应存在显著的异质性。从慢性淋巴细胞白血病和AML患者体内获得的样本在体外对标准化疗药物的敏感性与已知的临床治疗情况相符合，该测定方法检测到原发性和获得性耐药。结果表明，FMCA在鉴定化疗药物耐药性方面具有高度特异性，可能成为是一种简单，快速的方法，适用于白血病患者的化疗药物敏感性测试。FMCA法也有一定的缺点和局限，FDA探针测定受PH值变化的影响较大，影响细胞内PH值的药物可能会干扰FDA的测定结果；此外FDA还受到血清中酯酶的影响，实验前需要洗去细胞外酯酶以保证实验结果的准确性。

　　5. 三磷酸腺苷（ATP）生物荧光法：Rhedin AS利用生物发光ATP测定法评价抗白血病药物的体外细胞毒性作用能力26。该方法是将白血病细胞与化疗药物孵育培养后，培养体系中加入的荧光素-荧光素酶复合物与细胞内的ATP发生氧化反应而产生光子，通过监测荧光来检测ATP含量，从而分析细胞活性与增殖。ATP含量与荧光强度呈正比，从而反映白血病细胞对化疗药物的敏感性。

　　2018年Swords RT进行的一项队列研究27，采用体外药物敏感性检测平台对12名难治性AML患者进行评估。由215种美国食品药品监督局批准的抗癌化合物及药物组成的检测体系与经纯化后的AML患者骨髓白血病细胞在体外孵育72小时后，通过检测作用体系中ATP的水平，反映药物作用后白血病细胞的活性，给出药物敏感性评分。研究结果显示，3/5药物敏感性检测指导下化疗的患者表现出良好的临床疗效，而经验性治疗的患者均在治疗过程中出现疾病进展。因此，对于复发难治性AML患者，体外药物敏感性实验可以快速、有效的为患者提供个体化治疗的参考依据。采用ATP生物荧光法检测的优势为检测体系敏感、准确性高，稳定性好，易于操作，临床应用前景良好，缺点为耗时较长，并不适用于临床上发病急、病情重的急性白血病患者。

　　6. 细胞毒性差异染色法（differential staining cytotoxicity, DiSC）：Weisenthal28创立的DiSC法是评价细胞毒药物总体细胞杀伤情况的方法，可以应用于实体瘤及血液肿瘤29-31。该测定方法的基本原理是靶细胞与待测药物体外孵育培养结束后，加入一定数量的鸭红细胞至待测细胞组分中作为内参计数标准，通过快绿染料进行死活细胞的差异染色，涂片镜检，确定药敏实验中药物的杀伤效率。

　　P Staib等32,33采用DiSC方法检测了83例AML患者的骨髓样本，并与患者实际治疗后临床效果进行一致性评价。结果发现55例完全缓解患者及19例部分缓解患者（化疗后骨髓中白血病细胞比例小于10%）的临床化疗用药中，每位患者至少有一种药物经DiSC试验结果提示为敏感药物。而9例不缓解患者的DiSC试验结果显示对全部测试药物耐药。该方法总体预测化疗药物作用的精确性为100%，有望为临床提供个体化药物治疗的参考。DiSC法的优势在于通过结合形态学观察，可以区分培养体系中的正常细胞及恶性细胞，对于白血病药敏的预测与临床符合率较高。缺点是方法操作较复杂，且耗时较长，阅片计数易受主观因素影响。

　　上述这些技术体外培养过程类似，均为分离纯化的单个核细胞的体外杀伤实验，只是用于检测培养体系中细胞活力的方法不同。DNA掺入法和集落形成法的结果仅能反映少量增殖活跃的LSC细胞对药物的敏感及耐受情况；MTT法中，存活细胞将MTT转化为甲瓒，通过分光光度法定量。生物发光ATP测定是基于代谢活性测量细胞的ATP含量。FMCA法检测活细胞的胞内荧光。这些方法的共同点是检测实验终点培养体系中的所有活细胞，而不区分白血病细胞和正常细胞，故上述方法不能准确反映药物对白血病细胞的作用效果。DiSC虽能通过形态学辨别良恶性细。